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新型冠状病毒肺炎病毒核酸检测专家共识

时间:2020-02-13  来源:互联网 

突发新型冠状病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV)肺炎疫情以来,感染病例快速上升。随着疫情的发展和防控力度加大,全国各地乃至境外均有病例报道[1,2,3,4],及时对急重症及疑似患者进行诊断需要快速有效的方法,病毒核酸检测可为诊断提供直接证据[5,6]核酸检测过程中因对病原体的传染途径和致病力尚未完全明确,工作人员在核酸检测过程中存在较大的感染风险。此外,因为2019-nCoV基因结构与一般RNA差别较大,因此检验流程、检验质量和生物安全均需要有一定的指导。本共识在参阅国家卫生健康委员会相关文件、查阅文献、咨询重疫区相关专家的基础上进行编写,以对实验室检测工作提出有指导性的建议,本共识适用于从事2019-nCoV核酸检测的所有实验室。

适用范围

适用于2019-nCoV核酸检测,如采用逆转录PCR(RT-PCR)方法检测等。

工作程序

一、标本采集

(一)标本采集人员

采集人员必须经过院感管理部门或上级管理部门举办的生物安全培训,并考核合格。标本采集人员应按三级防护配备防护用品,包括工作服、防护服、一次性工作帽、医用防护口罩(N95)、外科口罩、护目镜、面罩、双层手套、防水靴和鞋套[7,8]配备防止病原微生物扩散和感染的设施,如处理感染性废弃物的垃圾桶、处理紧急意外事件的药具和具备一定的通风条件等。

(二)受检人群

新型冠状病毒肺炎疑似病例、确诊病例或与上述二者有密切接触史者[9]

(三)标本采集及包装

轻症患者、高度疑似患者或有密切接触史者,标本采集优选顺序为鼻咽拭子、口咽拭子、痰液,为提高阳性率,可同时采集1份鼻咽拭子和1份口咽拭子于同一标本采集管中;为观察疗效和控制传染源,可对确诊患者的粪便和血液进行检测。

1.鼻咽拭子:

标本采集管先贴好条形码,尽可能采集患者发病3 d内的鼻咽拭子标本。以拭子测量鼻尖到耳垂的距离并用手指做标记,将拭子以垂直鼻子(面部)方向插入鼻腔,拭子深入距离最少应达耳垂部位到鼻尖长度的一半,使拭子在鼻内停留15~30 s,轻轻旋转3~5次,迅速将拭子放入装有2 ml裂解液(与核酸提取试剂盒中裂解液相同)的标本采集管或含RNA酶抑制剂的细胞保存液中,插入拭子后在靠近顶端处折断无菌拭子杆,旋紧管盖并用封口膜封闭[10]

2.口咽拭子:

标本采集管先贴好条形码。尽可能采集发病3 d内患者的咽拭子标本。宜用无菌植绒拭子采样,适度用力拭抹咽后壁部位,应避免触及舌部;迅速将无菌拭子放入用于采集鼻咽拭子的采集管中,在靠近顶端处折断无菌拭子杆,旋紧管盖并用封口膜封闭[10]

3.痰液:

标本采集管先贴好条形码。收集痰液标本时不宜开放气道收集标本。收集深部咳嗽痰液于一次性无菌旋盖采样杯中,采样杯中装入2 ml蛋白酶K(1g/L)[11]收集痰液后旋紧杯盖并用封口膜封口,尽可能30 min内送检。如果需长距离运输标本时不宜先添加蛋白酶K。

4.肺泡灌洗液(BALF):

重症患者或病情进展迅速的肺炎患者,由临床医生无菌操作下吸取≥5 ml BALF到贴有标本条形码并带螺帽的50 ml无菌容器中。收集标本后旋紧标本盖并用封口膜封口。

5.血液:

发病后7 d内或危重症患者,或考虑病毒血症患者,可采集血液标本。标本采集管先贴好条形码。使用含有乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝剂的真空釆血管采集血液标本2~4 ml。

6.粪便:

如发病早期出现腹泻等消化道症状的患者,则留取粪便标本3~5 g(黄豆大小)。标本采集管先贴好条形码。标本收集于含2 ml生理盐水(有条件时可添加RNA酶抑制剂)的带螺帽标本采集管中并用封口膜封口。

7.标本包装:

采集标本后用75%乙醇喷洒标本采集管外部,立即放入标有"生物危险"密封袋中并封严封口;再用75%乙醇喷洒密封袋外部,然后放入标本转运容器,并对转运容器进行外部消毒,及时送检。

二、标本运输

标本应送至具备检测资质并经省级卫生行政主管部门批准可从事2019-nCoV核酸检测的PCR实验室[12]

1.送检时间和温度控制:

标本采集后应尽快送检,采集后应尽可能在2~4 h内送到实验室。在2 ~8 ℃下转运,运送时间应不超过72 h。如超过72 h,应-70 ℃或更低的温度下保存和转运。血液标本应分离血浆后进行保存和转运[9,13]

2.运输容器:

标本运输容器应当防水、防破损、防泄露、耐高(低)温和高压。运输容器和包装材料上应有相关规定的生物危害标识、警示语和提示语。运输容器应使用三层包装系统,即内层容器、中层包装和外层包装。防漏的内层容器包装后贴上生物危害标识,装入中层容器,将"感染性物品"标记贴在外层包装上。内层容器和中层容器间应放置足量的吸水性材料,中层容器应固定在硬质外层容器中。中层容器与外层容器间应放置凝胶冰袋[9,14]

3.院内运输:

标本运送人员进行二级防护并随身携带75%乙醇,以便发生意外时能及时处理,标本运送时宜派两人同行,条件允许时应配备标本转运监控装置。

4.长距离运输:

若标本需要远距离运输,应当按照《可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定》办理《准运证书》[15]2019-nCoV标本运输包装属于A类,对应的联合国编号为UN2814。转运者安全防护按二级防护要求佩戴,并随身携带75%乙醇。司机佩戴外科口罩或N95口罩,通过专用车辆运输。如果经航空运输,包装还应符合国际民航组织文件Doc9284-AN/905《危险品航空安全运输技术细则》[16]的PI602分类包装要求[9]至少由1名标本运送人员和司机同时转运标本,宜配备标本转运过程监控设施。

三、标本接收

1.生物安全防护:

标本接收人员按二级防护佩戴防护设备。

2.标本签收:

标本运送人员和接收人员对标本进行双签收。接收标本前应检查标本转运容器外包装有无破损,打开容器前用75%乙醇对标本转运容器进行喷洒或擦拭消毒。将标本转运容器放入生物安全柜,在安全柜中打开标本转运容器并立即用75%乙醇喷洒或擦拭消毒,取出标本密封袋后,对密封袋用75%乙醇喷洒或擦拭消毒,并检查是否密封好,立即将标本放入专用冰箱冷藏保存[17]

3.标本接收后保存:

标本接收后,若无法及时检测,可于4 ℃条件下短期(不超过24 h)保存,若需长期保存,可将标本于-70℃或更低的温度下保存[9]

四、试剂准备

1.试剂选择参考意见:

至少含2019-nCoV基因的两个位点(开放读码框1a/b、核壳蛋白N或E结构蛋白)[9],反应体系大,加样量大;检测试剂最好能与核酸提取仪配套使用,此外可选用引物不同的试剂盒便于对结果复核。

2.安全防护:

建议按三级防护要求进行防护;当条件不允许且各工作区分工作业时,试剂配制人员至少应按《医疗机构临床基因扩增检验工作导则》[18]穿工作服,戴一次性医用帽子和手套。

五、标本前处理

标本前处理及核酸提取操作的工作人员应进行三级防护。标本前处理应在具有外排功能的生物安全柜中操作。生物安全柜中应配备两个废弃物桶,一只桶中装0.55%~1%含氯消毒液,另一只桶中装1 mol/L稀盐酸。前一只废弃物桶用于丢弃标本、实验过程中产生的废液及与标本接触过的实验耗材;后一只废弃物桶用于装接触过核酸的耗材。废弃物桶应完整并醒目地标示废弃物内容。每次对标本进行操作后,用75%乙醇消毒后弃去外层手套,对内层手套用75%乙醇消毒后更换新外层手套。取出标本后用75%乙醇对标本外部进行喷洒或擦拭消毒。

(一)标本前处理

1.口咽拭子和鼻咽拭子:

可直接用于核酸提取,当实验室条件不够时可增加病毒灭活步骤[9],增加病毒灭活步骤可能会降低核酸检测的灵敏度。

2.血液:

1 500×g离心10 min,,离心后冰浴3~5 min,吸取血浆提取核酸。

3 肺泡灌洗液和粪便:

应充分振荡混匀后进行病毒灭活。

4 痰液:

先在55 ℃下孵育15 min后再进行病毒灭活[11]如果痰液标本采

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